2021年5月10日，國際期刊Nature Cell Biology在線發(fā)表了中國科學(xué)院上海營養(yǎng)與健康研究所楊力研究組與合作者在堿基編輯研究領(lǐng)域的最新進展“Eliminating base-editor-induced genome-wide and transcriptome-wide off-target mutations”。
堿基編輯器（base editor）主要是由兩個主要的功能結(jié)構(gòu)域組分組成，分別是識別基因組特定DNA序列定位的定位器（locator）和可對該特定基因組DNA序列（或者位點）進行編輯的效應(yīng)器（effector）。其中胞嘧啶堿基編輯系統(tǒng)主要以nCas9/sgRNA作為locater執(zhí)行對編輯的識別和定位功能，以胞嘧啶脫氨酶APOBEC/AID作為effector執(zhí)行胞嘧啶脫氨的功能并最終實現(xiàn)C-to-T的編輯。隨著堿基編輯技術(shù)的不斷開發(fā)，基因編輯效率和靶向范圍顯著提高，但是在全基因組和/或全轉(zhuǎn)錄組水平仍存在大規(guī)模的脫靶效應(yīng)，極大地限制了其在生物學(xué)和臨床上的應(yīng)用。在這項最新的研究工作中，研究人員首先發(fā)現(xiàn)了在胞嘧啶脫氨酶中天然存在的抑制序列結(jié)構(gòu)域（deoxycytidine deaminase inhibitor，dCDI），并利用其開發(fā)了一系列可高效催化靶位點C-to-T編輯、抑制脫靶位點C-to-T編輯的新型堿基編輯系統(tǒng)，并依據(jù)其特性命名為變形式堿基編輯系統(tǒng)（transformer base editors，簡稱tBEs）（圖示A）。結(jié)合高通量測序技術(shù)和計算生物學(xué)的研究方法，研究人員評估了tBE的編輯效率、脫靶效應(yīng)和編輯產(chǎn)物純度，結(jié)果顯示tBE堿基編輯系統(tǒng)可以在執(zhí)行高效C-to-T編輯的同時，最大程度地減少由locator產(chǎn)生的Cas9/sgRNA依賴性脫靶效應(yīng)（sgRNA-dependent off-target，OTsg）和effector產(chǎn)生的Cas9/sgRNA非依賴性單鏈DNA脫靶效應(yīng)（sgRNA-independent single-stranded off-target，OTss）。該研究還構(gòu)建了在全基因組檢測脫靶的計算分析流程BEIDOU（Base/Prime Editor Induced DNA Off-target site identification Unified toolkit, https://github.com/YangLab/BEIDOU）（圖示B），并結(jié)合全轉(zhuǎn)錄組RNA脫靶鑒定工具RADAR（RNA-editing Analysis-pipeline to Decode All twelve-types of RNA-editing events, https://github.com/YangLab/RADAR）（Wang et al., Cell Rep 2020），證明了tBE具有與本底水平類似的全基因組和全轉(zhuǎn)錄組突變效應(yīng)，提示tBE可能不具有早期BE3的脫靶效應(yīng)。該研究還成功地將tBE用于小鼠Pcsk9的編輯，通過引入終止密碼子的方法成功降低了小鼠體內(nèi)PCSK9的表達和LDL-C的水平。對編輯后小鼠進行全基因組和全轉(zhuǎn)錄組測序表明tBE在in vivo水平同樣僅產(chǎn)生與背景水平相一致的突變率。相關(guān)研究證明了tBE堿基編輯系統(tǒng)具有很好的特異性和安全性，提高了堿基編輯系統(tǒng)的應(yīng)用價值，拓展了堿基編輯系統(tǒng)在點突變引起的疾病治療中的應(yīng)用前景。
楊力研究員、上科大生命學(xué)院陳佳教授、武漢大學(xué)醫(yī)學(xué)研究院殷昊教授和上科大免疫化學(xué)研究所楊貝教授為該論文的共同通訊作者。楊力組博士生薛尉，陳佳研究組畢業(yè)生王麗潔博士和博士生高潤澤、殷昊研究組博士后張紅霞和碩博研究生邱厚圓為共同第一作者。本項研究得到了科技部、國家自然科學(xué)基金委、武漢大學(xué)、武漢市科技局、中科院青促會、教育部和博士后基金等項目的資助。
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圖示：(A) tBE作用的原理示意圖。以tBE-V5–mA3為例，其可在靶位點去除dCDI產(chǎn)生高效編輯效果，但在OTss和OTsg位點時由于dCDI的存在可以抑制非靶向突變。(B) BEIDOU計算分析流程評估堿基編輯的潛在全基因組水平脫靶。
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