2020年5月19日，國際學(xué)術(shù)期刊Cell Reports在線發(fā)表了中國科學(xué)院上海營養(yǎng)與健康研究所章海兵研究組的研究論文“Crucial roles of the RIP homotypic interaction motifs (RHIM) of RIPK3 in RIPK1-dependent cell death and lymphoproliferative disease”。該研究發(fā)現(xiàn)小鼠RIPK3蛋白V448P突變破壞C端RHIM結(jié)構(gòu)域?qū)е翿IPK1-RIPK3相互作用缺失從而抑制體外、體內(nèi)細(xì)胞程序性壞死（necroptosis）的發(fā)生；同時(shí)在FADD敲除小鼠中RHIM結(jié)構(gòu)域的V448P突變還導(dǎo)致嚴(yán)重的全身系統(tǒng)性淋巴增生特征的自身免疫性疾病（Systemic lymphoproliferative disease），而進(jìn)一步敲除RIPK1基因可以緩解系統(tǒng)性的淋巴細(xì)胞增生的發(fā)生。
細(xì)胞程序性壞死是一種新型的細(xì)胞炎性死亡方式，以胞質(zhì)內(nèi)蛋白形成壞死小體（necrosome），細(xì)胞膜打孔破裂釋放內(nèi)容物誘導(dǎo)炎癥為主要特征。壞死小體主要由受體相互作用蛋白激酶1和3（Receptor-interacting protein kinases 1/3，RIPK1/RIPK3）組成，RIPK1蛋白在人類疾病中發(fā)揮重要作用，有報(bào)道發(fā)現(xiàn)RIPK1基因突變導(dǎo)致單基因遺傳的自身炎癥性疾病。攜帶RIPK1突變的患者會(huì)發(fā)生反復(fù)感染、早發(fā)性炎癥性腸病等，正?；蛐偷脑煅杉?xì)胞移植可以緩解患者的炎癥表現(xiàn)。最新報(bào)道還發(fā)現(xiàn)攜帶RIPK1切割位點(diǎn)變異會(huì)導(dǎo)致患者早發(fā)周期性發(fā)熱癥和嚴(yán)重的淋巴細(xì)胞增生疾病。RIPK1與RIPK3通過蛋白C端功能域RIP homotypic interaction motifs (RHIM)形成同源或異源多聚蛋白復(fù)合體。而目前對(duì)于保守的VQIG氨基酸序列組成的RIPK3蛋白C端RHIM結(jié)構(gòu)域的生理功能及作用機(jī)制的研究仍不清楚。
研究人員首先在體外細(xì)胞表達(dá)實(shí)驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)，人源和鼠源的RIPK3蛋白呈現(xiàn)多聚體狀態(tài)并且誘導(dǎo)細(xì)胞發(fā)生細(xì)胞凋亡。通過CRISPR-Cas9敲除RIPK1、FADD、Casp3就能阻止過表達(dá)RIPK3引起的細(xì)胞凋亡。此外通過突變RHIM功能域上的重要位點(diǎn)，發(fā)現(xiàn)人源V460P、鼠源V448P不僅阻止RIPK3蛋白多聚體的出現(xiàn)也可以阻止細(xì)胞凋亡的發(fā)生。因此，體外實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明人源V460P、鼠源V448P都可以破壞RHIM介導(dǎo)的RIPK3多聚引起細(xì)胞凋亡的功能。
為了研究RIPK3蛋白R(shí)HIM功能結(jié)構(gòu)域的體內(nèi)功能，研究人員通過CRISPR-Cas9構(gòu)建V448P點(diǎn)突變knock-in小鼠。對(duì)小鼠原代細(xì)胞進(jìn)行細(xì)胞死亡誘導(dǎo)發(fā)現(xiàn)，V448P點(diǎn)突變細(xì)胞對(duì)RIPK1激酶依賴的細(xì)胞凋亡及細(xì)胞壞死都具有明顯的抵抗作用。免疫共沉淀實(shí)驗(yàn)也顯示，V448P點(diǎn)突變后的RIPK3蛋白不能與RIPK1發(fā)生相互作用。為進(jìn)一步證實(shí)V448P點(diǎn)突變抑制細(xì)胞壞死的作用，研究人員在FADD基因敲除小鼠中引入該突變，由于FADD敲除小鼠在胚胎發(fā)育時(shí)期由于發(fā)生過度細(xì)胞程序性壞死導(dǎo)致胚胎死亡，V448P點(diǎn)突變可以挽救FADD敲除導(dǎo)致的小鼠胚胎致死并存活到成年。這些實(shí)驗(yàn)結(jié)果在體外、體內(nèi)條件下均證實(shí)了RIPK3蛋白R(shí)HIM功能域在介導(dǎo)細(xì)胞死亡中的關(guān)鍵作用。
人類自身免疫性淋巴細(xì)胞增生綜合征（autoimmune lymphoproliferative syndrome，ALPS）是一種淋巴細(xì)胞增生為特征的自身免疫性疾病。該疾病的發(fā)生是因?yàn)榱馨图?xì)胞的死亡通路被阻斷，導(dǎo)致淋巴細(xì)胞的發(fā)育穩(wěn)態(tài)被破壞，表現(xiàn)為淋巴結(jié)腫大、脾臟腫大、淋巴瘤以及其它自身免疫性疾病的發(fā)生。研究人員發(fā)現(xiàn)FADD基因敲除小鼠中RIPK3基因V448P突變后小鼠表現(xiàn)為比RIPK3基因敲除更嚴(yán)重的系統(tǒng)性淋巴細(xì)胞增生疾病，而通過進(jìn)一步敲除RIPK1則可以緩解這個(gè)疾病的發(fā)生。這一意外發(fā)現(xiàn)表明RIPK3的RHIM功能結(jié)構(gòu)域不僅在介導(dǎo)細(xì)胞程序性壞死信號(hào)通路中具有關(guān)鍵作用，而且通過與RIPK1的相互作用在調(diào)控淋巴細(xì)胞發(fā)育及免疫穩(wěn)態(tài)中也發(fā)揮重要作用，這些發(fā)現(xiàn)為治療與細(xì)胞死亡相關(guān)的自身免疫性疾病提供了理論基礎(chǔ)和新的靶點(diǎn)。
中國科學(xué)院上海營養(yǎng)與健康研究所章海兵研究員為該論文通訊作者，博士研究生張海威以及助理研究員吳小霞為共同第一作者。該工作得到了上海交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院瑞金醫(yī)院羅艷教授、上海交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院公共衛(wèi)生學(xué)院王慧教授、廣州醫(yī)科大學(xué)蔣義國教授等的大力支持。該研究還得到了科技部、國家自然科學(xué)基金委及中國科學(xué)院等項(xiàng)目的資助，同時(shí)也得到了中國科學(xué)院上海營養(yǎng)與健康研究所公共技術(shù)平臺(tái)和動(dòng)物平臺(tái)的支持。（科技處）
文章鏈接：https://doi.org/10.1016/j.celrep.2020.107650
圖注: RIPK3 RHIM結(jié)構(gòu)域調(diào)控細(xì)胞死亡與炎癥的作用機(jī)制
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